Brain1 :

Brain 3:

Brain 8:

To Do:

• Verify transformation via QC (Overlay etc.)
• Capture brains at higher resolution
• Apply transformation to GFP channel > identify PPL1 neurons?

I selected the cells with different combination of markers and different levels of expression. In addition to split-gal4 driver markers I also added FoxP, aPKC and VGlut to get more specific results. gene names on graph legends are not correct and will be fixed

IS38497 b1 and b3 motor driver line

AD: beat-IIIB DBD: bab1

SS98650 b3 driver

AD: ct DBD: Ubx

IS69306 b1 mn driver line

AD: CG14388 DBD: CG31345

SS48311 b3 mn driver

AD: Ubx DBD: NetB

SS40980 b1 mn driver line

AD: CG12680 DBD: CG10137

Ich habe nun die ausstehenden Hintergrundkontrollen für das Buridan-Experiment nachgeholt: die Driver Control (DC) und die Effector Control (EC). Ziel war es zu sehen, wie sich deren visuelles Fixations- und Laufverhalten im Vergleich zu den bisherigen Daten (Linie 14 und der gepoolten Linie 5,6) verhält.  

Hier sind die Ergebnisse und ein paar unerwartete Auffälligkeiten:

Linie 5 und 6: Es ist tatsächlich sehr auffällig, dass die experimentelle Linie 5,6 (mit den stummgeschalteten Neuronen) sauberer und fokussierter läuft als die Kontrollen und Linie 14. Im Transition Plot von Linie 5,6 sieht man einen scharf abgegrenzten, sanduhrförmigen Korridor zwischen den Streifen. Eigentlich sollte das nicht so sein, da man bei einer neuronalen Blockade eher eine Verschlechterung des Verhaltens erwartet. Hier fixieren sie aber besser als die Kontrollen. Anscheinend führt die Blockade dieser Neurone hier zu keinem Defekt. 

Auffälligkeiten bei der Effector Control (EC):

Auch wenn nicht so gut wie Linie 5,6, zeigt DC eine solide Fixierung. EC verhält sich ganz anders. Diese Fliegen laufen zwar viel und sind aktiv, aber ihr Transition Plot zeigt keinen schönen, schmalen Korridor, sondern einen großen, runden, roten Fleck genau in der Mitte der Arena. Es sieht so aus, als ob die EC-Fliegen sich bevorzugt im Zentrum im Kreis drehen, statt sauber zwischen den Streifen hin und her zu wechseln.  

Zusammenfassend lässt sich sagen: Die Ergebnisse sind zwar unerwartet, aber anscheinend sind die Fliegen trotz der gehemmten Neuronen immer noch vollkommen in der Lage, visuelle Reize wahrzunehmen und die Streifen zu fixieren – sie tun es hier seltsamerweise sogar besser als die Kontrollen.

Ich habe in den letzten zwei Wochen die ersten Durchläufe im Buridan-Paradigma gemacht. Ziel war es, das visuelle Fixations- und Laufverhalten derselben drei Fliegenlinien (Linie 5, 6 und 14) zu vergleichen. 

Hier ist zunächst ein Blick auf die allgemeinen Laufparameter, um sicherzustellen, dass die Fliegen fit sind:

Wie man sieht, gibt es bei der mittleren Geschwindigkeit (median_speed) und der zurückgelegten Distanz keine massiven Ausreißer. Alle drei Linien sind motorisch fit und aktiv. Das bedeutet, dass eventuelle Unterschiede in der räumlichen Orientierung nicht einfach auf Erschöpfung oder motorische Defekte zurückzuführen sind. 

Transition plots:

Wenn man das klassische Wildtyp-Verhalten im Kopf hat (ein scharf abgegrenztes, sanduhrförmiges Muster zwischen den beiden Streifen), fällt sofort ein deutlicher Unterschied auf: Die “gebalancede” Linie 14 zeigt ein sehr diffuses Laufmuster. Die Fliegen scheinen die Streifen kaum richtig zu fixieren und laufen eher kreuz und quer durch die Arena. 

Überraschenderweise zeigen die experimentellen Linien 5 und 6 (die Tetanustoxin-Kreuzungen) ein etwas fokussierteres Verhalten! Bei beiden Linien erkennt man deutlich den vertikalen Korridor zwischen den Streifen.

Dieser visuelle Eindruck lässt sich auch wunderbar durch unsere statistischen Parameter untermauern:

Stripe Deviation: Der Plot bestätigt den Blick auf die Heatmaps schwarz auf weiß. Linie 14 zeigt die größte Abweichung von der Ideallinie (stripe_deviation), während die Linien 5 und 6 ein wenig besser auf Kurs bleiben und die Streifen enger fixieren.

Centrophobism (Sitting): Während Linie 14 beim Pausieren keine echte Präferenz für die Mitte oder den Rand zeigt (Median nahe 0), haben die Linien 5 und 6 negative Werte. Das bedeutet, sie verbringen ihre Pausen, im Vergleich, bevorzugt im Zentrum der Arena, genau dort, wo auch ihre Hauptlaufroute verläuft. 

Fazit für heute: Obwohl bei den Linien 5 und 6 durch das Tetanustoxin bestimmte Neuronen blockiert sein sollten, zeigen sie ein etwas zielstrebigeres und “wildtyp-likeres” Fixationsverhalten als unsere gebalancede Kontrolllinie 14.

Als ich anfing, ging es bei mir gleich mit einem klassischen neurobiologischen Experiment los: der optomotorischen Wendereaktion. 

Zunächst übte ich mich von Mitte bis Ende März an Wildtypen, den ganzen April über stand ich für die eigentlichen Experimente im Labor, um drei verschiedene Fliegenlinien zu testen: 

• Linie 14: Das ist meine eingekreuzte Kontrolle, gebalanced über den TM6-Marker. Hier sollte das Nervensystem völlig intakt sein. 

• Linie 5 & Linie 6: Das sind die reziproken Kreuzungen aus UAS-TnTG(211) und der Gal4-Treiberlinie R23G12. Hier wird Tetanustoxin (TnT) exprimiert, welches die synaptische Übertragung in den angesteuerten Neuronen blockiert, die Neurone werden also quasi stummgeschaltet. 

Ergebnisse Linie 14

Die Kontrollfliegen zeigen eine starke, koordinierte Wendereaktion. Das System funktioniert also! 

Da Linie 5 und Linie 6 genetisch reziproke Kreuzungen sind, habe ich die Daten Anfang Mai gepoolt, um eine solidere Datenbasis zu bekommen:

Im direkten Vergleich zur Kontrolle ist die optomotorische Wendereaktion bei den TnT-Fliegen massiv abgeflacht und über weite Teile der Reize fast vollständig inhibiert. Das Stummschalten der über R23G12 angesteuerten Neurone scheint die visuelle Folgereaktion also empfindlich zu stören oder gar ganz zu unterbrechen. 

MB032B>UAS-mCD8::GFP; aGFP (rabbit), NC82 (aBrp, mouse), GAR AF 488, GAM AF 555; Leica SP8, 20x immersion oil

MB299B>UAS-mCD8::GFP; aGFP (rabbit), NC82 (aBrp, mouse), GAR AF 488, GAM AF 555; Leica SP8, 20x immersion oil

Janelia Fly Light Split-GAL4 reference

MB304B>UAS-mCD8::GFP; aGFP (rabbit), NC82 (aBrp, mouse), GAR AF 488, GAM AF 555; Leica SP8, 20x immersion oil